Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (cylas formicarius)

Hình 1.3. Hình ảnh tạo khối u gây ra do A. tumefaciens (trái)
và rễ tơ do A. rhizogenes (phải)
- Vector chuyển gen: Có cấu trúc từ Ti-plasmid với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các
gen không cần thiết như gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa hai trình tự biên trái (T-border
left) và biên phải (T-border right), gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm:
- Vector bổ trợ: cấu trúc gồm các gen vir được tách và đưa vào chung một plasmit
đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmit này được cải biến loại bỏ gen
kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, những vẫn duy khả năng thâm nhập vào tế
bào thực vật.
1.3.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ

Hình 1.4. Nuôi cấy rễ tơ G.glabra
a: Bằng hệ thống bioreactor
b, c: Thu hoạch sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy
(Nguồn:http://www.ejbiotechnology.info/content/vol11/issue2/full/6/f4.jpg&imgrefurl)
Rễ tơ có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất
điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra.
Hê
̣
thống rê
̃
đa bô
̣
i la
̀
nơi ly
́
tươ
̉
ng đê
̉
sa
̉
n sinh ra ho
́
a chất thư
̣
c vâ
̣
t va
̀
chu
́
ng rất ô
̉
n đi
̣
nh về di
truyền. Rễ tơ có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, sinh trươ
̉
ng nhanh. Đặc biệt hơn
ở hệ thống nuôi cấy lỏng các mô tế bào thực vật việc biểu hiện dược phẩm sinh học tái tổ
hợp ra ngoài môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giản hơn rất nhiều trong quá trình tinh
sạch các dược phẩm sinh học này.
Cho tới nay, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất thành công các protein tái tổ hợp hay
các dược phẩm sinh học tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy rễ tơ như SEAP protein huỳnh
quang kết hợp với protein ricin B (GFP-ricin B, fungal phytase, và đặc biệt hơn cả là các
kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể.

Hình 1.5. Một số ứng dụng của rễ tơ
(nguồn: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii)
1.3.4. Yếu tố ảnh hưởng lên quá trình chuyển gen nhờ Agrobacterium
Trong thực tế Agrobacterium thường chỉ gây hại ở cây hai lá mầm. Vì vậy tần suất
chuyển nạp gen ở cây hai lá mầm cao hơn nhiều so với cây một lá mầm.
Hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở thực vật phụ thuộc vào một số yếu
tố như tiền xử lý mô thực vật, nguồn vật liệu gây nhiễm, nồng độ vi khuẩn, thời gian lây
nhiễm và đặc biệt là khả năng tái sinh của thực vật sau biến nạp
1.4. Gen có hoạt tính gây độc ở Bacillus thuringiensis (Bt)
1.4.1. Sơ lược về Bt
Bt là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, kỵ khí hoặc hiếu khí tùy tiện, là chủng vi
khuẩn đất điển hình. Sinh trưởng ở nhiệt độ 15-45
0
C nhưng thích hợp nhất ở nhiệt độ 29-
32
0
C. Genome của Bt có kích thước 2,4 - 5,7Mb, phần lớn có chứa một hay nhiều plasmid
khác loại.

Hình 1.6. Bào tử và tinh thể độc ở Bacillus thuringiensis
A-Tế bào Bt dưới kính hiển vi điện tử; B - Tinh thể độc; C- Tinh thể độc phóng to;
sp- bào tử; c-tinh thể độc
(Nguồn: http://aem.asm.org/content/74/4/923/F1.expansion)
Bt có khả năng sản sinh protein tinh thể độc ở dạng ngoại bào (, ,  - exotoxin) và
nội bào (- endotoxin). Trong các protein tinh thể độc, - endotoxin là một họ protein tinh thể
độc chính gây độc hệ tiêu hoá của côn trùng. Trong các loại độc tố, thì -endotoxin (Cry
toxins), -exotoxin là các độc tố được nghiên cứu nhiều nhất về mặt phân tử và phổ tác dụng
với côn trùng.
1.4.2. Phân loại gen mã hoá độc tố của Bt
1.4.2.1 Các gen nội độc tố cry
Năm 1989, Whiteley đã xây dựng một hệ thống phân loại các gen cry. Dựa trên sự
khác nhau về trọng lượng protein, phổ tác dụng với côn trùng được chia thành năm nhóm
chính bao gồm: Gen thuộc lớp cry I (A, B, C) gây độc với các côn trùng thuộc Bộ Cánh vảy;
Các gen thuộc lớp Cry II gây độc lên cả hai Bộ Cánh vảy và Hai cánh; Gen cry III (A, B, C,
D, E) gây độc với ấu trùng thuộc Bộ Hai cánh; Các gen thuộc lớp cry IV gây độc với côn
trùng thuộc Bộ hai cánh; Nhóm gen cry V có độc tính với côn trùng thuộc Bộ Cánh cứng và
Cánh vảy

Bảng 1.2. Phân loại độc tố cry (Nguồn: Tổ chức y tế thế giới, 1999)
Gene
Hình dạng
tinh thể độc
Trọng lƣợng
protein (kDa)
Tác động lên côn
trùng
Cry I [phân nhóm: A(a), A(b), B,
C, D, E, F, G]
Thoi
130-160
Bộ cánh vảy
Cry II [phân nhóm A, B, C]
Tháp
68-71
Bộ cánh vảy, hai
cánh
Cry III [phân nhóm A, B, C]
Thoi
66-73
Bộ hai cánh
Cry IV [phân nhóm A, B, C, D]
Thoi/tháp
72-135
Bộ hai cánh
Cry V-IX
Nhiều loại
35-129
Nhiều loại
1.4.2.2. Các gen ngoại độc tố khác
Gen cytA: Là gen tổng hợp nên protein độc với tế bào động vật có xương sống và
không xương sống, hồng cầu động vật có vú.
Nhóm gen vip: Gen vip mã hoá các protein trong pha sinh dưỡng trong chu trình phát
triển của vi khuẩn Bt và Bc có hoạt lực diệt côn trùng có phổ tác dụng mạnh hơn các protein
độc do gen cry mã hóa. Cơ chế tác dụng độc của các loại protein Vip bước đầu cho thấy
giống như cách tác dụng của tinh thể - endotoxins.
1.4.3. Cấu trúc và cơ chế tác động của protein cry gây độc cho côn trùng
Tinh thể độc có thể chiếm đến trên 25% trọng lượng khô của tế bào có bản chất là
protein, được tổng hợp trong pha cân bằng của Bt

Hình 1.7. Cấu trúc của độc tố Cry 3A
(nguồn: http:// www.bioc.cam.ac.uk/UTOs/Ellar.html)

Các protein độc của Bt hoạt động có chung một cơ chế tác động gây độc chung với
côn trùng gồm 3 bước chính: Hoạt hóa tiền độc tố; Gắn độc tố lên các tế bào biểu bì ruột;
Làm mất cân bằng áp suất thẩm thấu và phá vỡ tế bào làm côn trùng chết.

Hình 1.8. Mô hình hoạt động của protein Cry gây độc đối với côn trùng [56]

1.4.4. Một số thành tựu tạo cây khoai lang chuyển gen
Có rất nhiều các nghiên cứu nhằm tăng cường khả năng tái sinh cây khoai lang in
vitro và các nghiên cứu hệ thống chuyển gen sử dụng vector chỉ thị bằng phương pháp
bắn gen hay thông qua Agrobacterium. Gần đây, một số công trình nghiên cứu đã công
bố về tạo cây khoai lang chuyển gen có ích như gen cry kháng côn trùng qua hệ thống
chuyển gen bằng Agrobacterium
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về hệ thống tái sinh và hệ thống chuyển
gen vào cây khoai lang sử dụng vector mang gen chỉ thị để nhằm mục đích hoàn thiện
qui trình chuyển gen làm cơ sở cho bước chuyển gen sau này.


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Vật liệu
a. Thực vật:
Thực vật được sử dụng trong nghiên cứu là các mảnh lá, đoạn thân và chồi giống
khoai lang KB1 thu thập từ Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam, nuôi cấy trong điều kiện
in vitro.
b. Chủng vi khuẩn:
- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834/PTN289 (Viện Sinh học phân tử và
Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức)
- Chủng Agrobacterium rhizogenes pIBT/cry3
2.1.2. Hóa chất
Các môi trường nuôi cấy:
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: YMP
- Môi trường nuôi cấy thực vật MS
- Môi trường đồng nuôi cấy và cảm ứng tạo rễ tơ: WPM
Các loại kháng sinh: Kanamycine, Cefotaxime, Spectinomycine.
Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử thuộc Viện Công nghệ Sinh học mua
từ các hãng nổi tiếng như Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New
England Biolabs
2.1.3. Thiết bị
Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô thực vật; dùng trong sinh học phân tử của phòng
Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm gen.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuyển gen thông qua Agrobacterium
2.2.1.1. Tạo dịch huyền phù Agrobacterium
Agrobacterium được nuôi ở nhiệt độ 28
0
C trên các môi trường: Trên môi trường thạch
YEP bổ sung 50 mg/L spectinomycine trong 36-48 giờ. Lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi
trong 5ml môi trường YEP lỏng bổ sung 50mg/L spectinomycine, sau 8 giờ, chuyển toàn bộ
5ml dịch nuôi cấy trên sang 45ml môi trường YMP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine
nuôi lắc 220 vòng/phút, sau 16-18 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm với
tốc độ 6000-6500 vòng/ phút, ở 4
0
C trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môi
trường 1/2 MS (pH=5,8) và pha loãng cho tới OD
600
 0.5-0.9.
2.2.1.2. Nhiễm vi khuẩn với mảnh lá
Lá bánh tẻ và đoạn thân của các cây khoai lang nuôi cấy in vitro được cắt thành
những mảnh nhỏ có kích thước 1cm
2
, sau đó được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn
khoảng 10-30 phút ở nhiệt độ phòng, tiếp đến được đặt lên môi trường WPM và nuôi trong
tối 48 giờ, ở nhiệt độ 26
0
C

 2
0
C. Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường cảm ứng các mảnh lá
được chuyển sang môi trường chọn lọc.
2.2.2. Đánh giá cây trồng chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen gus.
Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất
X-Gluc. Sau 24-48 giờ mẫu nhuộm được tẩy hết diệp lục bằng Ethanol 70% và quan sát trên
kính lúp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là
phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.
2.2.3. Tách, tinh sạch DNA tổng số
Các mẫu sau biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc, sau 30 ngày lựa chọn các
dòng rễ trắng, đầu rễ không bị thâm đen, sinh trưởng tốt để nuôi sinh khối trên môi trường
WPM lỏng. Sau 30-45 ngày mang đi tách và tinh sạch DNA tổng số theo phương pháp của
Gawel và Jarret (1991).
2.2.4. Kiểm tra gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR
Các dòng sinh khối rễ sau khi tách DNA được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với các cặp
mồi cry3, virC để kiểm tra và khẳng định sự hiện diện của gen cry3 trong các dòng rễ biến nap.
Trình tự các cặp mồi cry3 và virC được sử dụng để đánh giá hiệu quả biến nạp gen cry3
vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogenes
cry3_F
5’-GTTTAAGGATTATGTTTCCGCCCT-3’
cry3_R
5’-ATTCAAGGTTTTGGACATCCAGAG-3’
virC_F
5'-ATCATTTGTAGCGACT-3'
virC_R
5'-AGCTCAAACCTGCTTC-3'

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT
Thành phần
Thể tích (µl)
1
Nước deion khử trùng
12,5
2
Buffer 10x
2,5
3
dNTPs
2,0
4
DNA
5,0
5
Taq polymerase
1,0
6
Primer F
1,0
7
Primer R
1,0
Tổng
25

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc
Phản ứng
Nhiệt độ (
0
C)
Thời gian (giây)
Số chu kỳ
1
Biến tính
95
180
1
2
Biến tính
93
30
35
3
Gắn mồi
52
30
4
Kéo dài chuỗi
72
70
5
Hoàn tất chuỗi
72
10 phút
1
6
Kết thúc phản ứng
4
∞


2.2.5. Điện di sản phẩm PCR trên agarose, nhuộm Ethidium Bromide và đọc kết quả trên
máy soi gel
Phương pháp điện di trên gel agrose được sử dụng để kiểm tra kết quả DNA tổng số,
kiểm tra các phân đoạn DNA được nhân bằng kĩ thuật PCR…
Mẫu DNA tách chiết được điện di với dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100-
130V, cường độ dòng điện 60 – 80mA. Kết thúc mẫu được nhuộm với EtBr: Bản gel được
lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr (10g/ml) trong thời gian 20 phút. Gel được
quan sát dưới ánh sáng tử ngoại.
2.3. Tách protein tổng số thực vật
Rễ khoai lang nuôi cấy invitro 30-45 ngày trong môi trường WPM lỏng, được sử
dụng để tách protein tổng số: Rễ được rửa sạch, làm khô, nghiền nhỏ và bổ xung đệm chiết
PBS + tween 0,05%. Kết thúc thời gian chiết mẫu được ly tâm 12000 vòng/phút trong thời
gian 10 phút, ở 4
0
C. Thu phần dịch nổi
2.4. Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm
Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.
- Dựng đường chuẩn.
Từ dung dịch chuẩn BSA có nồng độ 0; 0,25; 0,5; 1; 2,5mg/ml, được thêm dung dịch
thuốc thử Bradford và đo OD ở bước song 595nm. Từ các giá trị OD thu được dựng đường
chuẩn và xây dựng phương trình tuyến tính.
- Xác định nồng độ protein trong mẫu.
Mẫu được bổ xung thuốc thử Bradford và đo OD ở bước song 595nm.
Từ các giá trị OD
595
thu được và phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein
với mật độ quang tính được hàm lượng protein trong các mẫu phân tích.
2.5. Xác định hoạt lực diệt côn trùng của protein lên sâu non bọ hà
2.5.1. Nuôi sâu non bọ hà
Nuôi khoảng 200 bọ hà trưởng thành trong hộp nhựa có 3-4 củ khoai lang. Giữ các
hộp này trong tối ở 30
0
C. Để thu được sâu non đồng đều cho thí nghiệm, cứ sau 3 ngày lại
chuyển bọ trưởng thành sang một hộp khoai mới. Sau 2 tuần, mỗi hộp sẽ có khoảng 500 sâu
non cho thí nghiệm. Sử dụng sâu non tuổi 2 cho thí nghiệm.
2.5.2. Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà
Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà bao gồm 15 thành phần (phụ lục 2). Các thành
phần này được trộn lẫn với nhau, thêm agar (40g/l) và khử trùng.
2.5.3. Đánh giá hoạt lực của protein lên sâu non bọ hà
Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà được khử trùng, làm nguội, đổ vào các giếng với
200l thức ăn/giếng. Để khô ở nhiệt độ phòng. Bổ xung thêm 20g; 40g/ml prtein tách
chiết ở trên lên bề mặt thức ăn, để bay hơi tự nhiên. Sử dụng đệm pha loãng protein làm đối
chứng. Mỗi giếng thả một sâu non tuổi 2 và nuôi trong tối ở 28
0
C. Quan sát đĩa sâu hàng
ngày để đếm số sâu chết ở các giếng.
2.6. Phƣơng pháp sử lý số liệu
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng ANOVA với độ tin cậy 95%.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân tích biểu hiện tạm thời của gen gus
3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen vào khoai lang

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng biến nạp
Thời gian
lây nhiễm
(phút)
Tổng số
mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus
Giá trị trung
bình
Tỷ lệ % các
mảnh bắt màu
xanh
Lần 1
Lần 2
Lần 3
10
100x3
16
19
20
18,33+4,33
18,33+4,33
20
100x3
42
45
41
42,67+4,33
42,67+4,33
30
100x3
30
31
27
29,33+4,33
29,33+4,33

Qua biểu hiện tạm thời của gen gus trên các mô lá, kết quả cho thấy sự khác biệt là có
ý nghĩa (α = 0,05) trong các khoảng thời gian lây nhiễm là 10 phút, 20 phút và 30 phút. Dựa
vào kết quả trên chúng tôi chọn thời gian lây nhiễm 20 phút cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp
Đồng nuôi
cấy (ngày)
Tổng số
mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus
Giá trị trung
bình
Tỷ lệ % các
mảnh bắt màu
xanh
Lần 1
Lần 2
Lần 3
2
100x3
20
20
21
20,33+0,33
20,33+0,33
3
100x3
19
20
23
20,67+4,33
20,67+4,33
4
100x3
20
21
21
20,67+0,33
20,67+0,33

Qua bảng trên cho thấy khi thời gian đồng nuôi cấy tăng từ 2 đến 4 ngày tỷ lệ các mẫu dương
tính khi nhuộm gus khác nhau không nhiều (từ 20,33% và 20,67%). Kết quả sự khác biệt
không có ý nghĩa thống kê (α = 0,05). Vì vậy chúng tôi lựa chọn thời gian đồng nuôi cấy 2
ngày cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào vi khuẩn đến khả năng biến nạp

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn đến khả năng biến nạp
Mật độ tế bào
vi khuẩn
(OD)
Tổng số
mẫu
Số mảnh cấy bắt màu
xanh khi nhuộm gus
Giá trị trung
bình
Tỷ lệ % các
mảnh bắt màu
xanh
Lần 1
Lần 2
Lần 3
0,5
100x3
14
13
14
13,67+0,33
13,67+0,33
0,6
100x3
17
19
22
19,33+6,33
19,33+6,33
0,7
100x3
29
30
32
30,33+2,33
30,33+2,33
0,8
100x3
36
35
38
36,33+2,33
36,33+2,33
0,9
100x3
22
20
25
22,33+6,33
22,33+6,33

Theo bảng trên cho thấy kết quả dương tính khi nhuộm gus cao nhất đối với dịch
huyền phù vi khuẩn có OD
600
= 0,8 đạt 36,33%. Với α=0,05 kết quả cho thấy sự khác biệt
trong hiệu quả biến nạp giữa các giá trị OD là có ý nghĩa. Chúng tôi sử dụng mật độ tế bào vi
khuẩn có giá trị OD
600
= 0,8 cho các nghiên cứu tiếp theo.

A

B
Hình 3.1. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus
A. Mẫu lá âm tính B. Mẫu lá dương tính (chuyển xanh do gen Gus)
3.1.4. Ảnh hưởng của chất cảm ứng (AS) đến khả năng biến nạp
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ chất cẩm ứng AS đến khả năng biến nạp
Nồng độ AS
(µM)
Tổng số
mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus
Giá trị trung
bình
Tỷ lệ % các
mảnh bắt màu
xanh
Lần 1
Lần 2
Lần 3
0
100x3
30
32
32
31+1,33
31+1,33
100
100x3
39
42
40
40,33+2,33
40,33+2,33
150
100x3
40
38
41
39,67+2,33
39,67+2,33
200
100x3
39
42
42
41,00+3,00
41,00+3,00
Kết quả bảng trên cho thấy khi bổ xung thêm AS vào biến nạp thì hiệu quả biến nạp
tăng lên rõ rệt giữa mẫu đối chứng với các mẫu có sử dụng AS. Tuy nhiên giữa các mẫu có
bổ xung AS thì sự khác nhau trong hiệu quả biến nạp là không nhiều (α=0,05). Vì vậy để
giảm chi phí chúng tôi lựa chọn bổ xung AS có nồng độ 100µM vào môi trường biến nạp cho
các thí nghiệm chuyển gen cry.

A

B
Hình 3.2. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus
A. Rễ âm tính B. Rễ dương tính (chuyển xanh do gen gus)
3.2. Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogens
3.2.1. Sơ bộ đánh kết quả chuyển gen thông qua A. rhizogens mang vector pIBT/cry3
Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogens, mẫu lá được đặt trên môi trường
chọn lọc WPM. Tỷ lệ cảm ứng tạo rễ của các mẫu trên môi trường chọn lọc có 500 mg/L
cefotaxime và kanamycine 50mg/L sau khi nhiễm với A. rhizogens và mẫu đối chứng.

Hình 3.3. Rễ tơ ở các mô chuyển gen

Thí
nghiệm
Tổng số
mẫu
Số mô
sống sau
1 tuần
Số mô
sống sau 2
tuần
Số mô
sống sau 3
tuần
Số mô
sống sau
4 tuần
Số mô cảm
ứng tạo rễ
Biến nạp
300
235
197
149
103
18
Đối chứng
50
0
0
0
0
0
Ở mẫu đối chứng các mẫu bị vàng và chết ở ngay tuần đầu tiên khi nuôi trên môi
trường chọn lọc. Ở mẫu biến nạp các mô sống sót trên môi trường chọn lọc giảm dần theo
thời gian. Các dòng rễ tơ này tiếp tục được chọn lọc trên môi trường nuôi cấy lỏng tạo sinh
khối để tách DNA và kiểm tra bằng phản ứng PCR.

A

B

Xem chi tiết: Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (cylas formicarius)